Pour déterminer si une tortue est mâle ou femelle, il faut tenir compte d'un certain nombre d'éléments.
Dossière : Les femelles de certaines espèces ont tendance à avoir une dossière légèrement plus convexe.
Plastron : Le plastron des mâles de certaines espèces est plus concave que celui des femelles, qui est presque plat : cette particularité permet au mâle de mieux s'adapter à la forme convexe de la dossière de la femelle pendant l'accouplement. Chez les femelles, ce plastron plat permet d'avoir plus d'espace disponible pour le développement des oeufs. Chez certaines femelles, par exemple les Testudo graeca, on trouve, en outre, sur le plastron une articulation qui permet une certaine mobilité de la partie arrière, de manière à faciliter le passage des œufs.
Écaille supracaudale : Cette écaille de la dossière, placée directement au-dessus de la queue, présente souvent chez le mâle un profil plus recourbé, alors que chez la femelle, elle est relativement plate : cette caractéristique est particulièrement évidente chez les Testudo hermanni et elle est probablement destinée à faciliter la ponte.
La face : Chez certaines espèces, les mâles présentent des glandes qui grossissent pendant la saison des accouplements. Dimensions : Dans la plupart des espèces, les femelles adultes ont une taille supérieure à celle des mâles.
Queue : Le mâle adulte a en général une queue plus grosse et plus longue et le cloaque est plus loin de la base de la queue : cette caractéristique est probablement liée à l'accouplement car elle facilite la pénétration du pénis du mâle dans le cloaque de la femelle.
Chez les Terrapene, l'iris de la plupart des mâles est d'une couleur plus vive que celui des femelles (rouge chez le mâle et marron chez la femelle). Chez certaines espèces, par exemple les tortues Boîte, la couleur de la tête et des yeux est différente selon le sexe.